使用Geneious快速定位基因魔剪CRISPR/cas的gRNA位点与脱靶结合位点[2]

基于机器学习翻译，仅供参考

练习1：查找CRISPR位点

在本练习中，您将运行Find CRISPR位点功能来查找LYP1 CDS序列上的“GN（20）GG”CRISPR网站。

选择LYP1 CDS（这个文件是geneious专用的demo数据格式，当您下载了geneious可以导入进去使用，或者导入您感兴趣领域的数据）文档，然后转到克隆→查找CRISPR位点。

首先，将选项重置为默认设置。要做到这一点，点击窗口左下角的齿轮，并选择重置为默认值（如果当前设置为默认设置，这将变为灰色）。

由于我们想要在此序列中的任意位置查找CRISPR位点，因此在绑定位点旁依次选择无处不在。

在Motif面板中，使用Target和PAM字段指定要搜索的gRNA序列。如果您希望评估所有潜在的CRISPR位点，请在目标框中输入N（20）。或者，如果您想要检查异地绑定的特定序列，则可以在目标框中输入确切的序列。在本教程中，我们对“GN（20）GG”指南序列感兴趣。目标序列为GN（19），PAM序列为NGG，因此目标字段类型为“GN（19）”，PAM Site字段类型为“NGG”。这些字段下方的预览显示了该目标和PAM序列的指导序列 - 即GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG

在本练习中，我们只关注“GN（20）GG”位点在序列中的位置，因此取消选中通过脱靶分析对位点进行评分的选项。我们要评估每个位点的活动，因此请通过检查目标活动来保持分数网站。对话框现在应该如下图所示。点击确定运行搜索。

 

Geneious将使用“GN（20）GG”基序鉴定该序列上的任何CRISPR位点并对其进行注释。“查找CRISPR位点”功能每次运行的注释都被分组到一个标有CRISPR位点的新轨道中。CDS中有41个“GN（20）GG”CRISPR位点。

将鼠标悬停在其中一个网站上，您将看到一个弹出式窗口，其中包含有关该网站的信息。该信息包括On-target活动评分，其是在该位点的gRNA结合和Cas9切割效率的量度，如在Doench等2014中所计算的。此分数是介于0和1之间的数字，数字越高表示预期活动越高。CRISPR位点注释根据此分数自动着色，从绿色（高分）到黄色和红色（差分）的渐变。

 

要从序列中删除这些注释，请单击序列视图中曲目名称左侧的箭头，然后选择删除曲目。

未完，继续第三[3]部分