使用Geneious快速定位基因魔剪CRISPR/cas的gRNA位点与脱靶结合位点[4]
练习3：查找CRISPR位点并检查脱靶匹配
在之前的练习中，您对LYP1基因上的所有“GN（20）GG”位点进行了与啤酒糖酵母基因组的脱靶结合的评分 。由于酿酒酵母基因组相对较小并且LYP1基因上仅有少量“GN（20）GG”位点，因此该搜索相对较快。但是，如果您正在测试针对较大基因组（例如，人类基因组）的脱靶结合和/或对较大数量的CRISPR位点进行评分，则此搜索可能需要很长时间。在本练习中，我们将使用Find CRISPR位点工具中的其中一种替代搜索策略来丢弃一些网站并加快搜索速度。
选择LYP1 CDS文档（geneious的demo数据，可以下载）并转到克隆→查找CRISPR位点。
如前面的练习中，在Binding位点旁边依次选择Anywhere。在目标类型“GN（19）” 旁边的字段以及PAM Site字段中键入“NGG”。
在本练习中，我们希望使用其中一种替代搜索策略来丢弃具有强大异地匹配的CRISPR位点，因此在“ 速度和过滤器”策略下选择“ 快速” - 丢弃更多位点。脱靶数据库仍应设置为酵母基因组文件夹。
对话框现在应该如下图所示。点击确定运行搜索。
使用这种搜索策略，Geneious仅在该序列中注释了五个CRISPR位点。
在搜索结果中，任何发现与PAM位点中没有不匹配或在PAM位点旁边的前8bp内发现有脱靶匹配的位点都将从搜索中删除。Geneious没有为这些位点寻找进一步的非目标匹配，CRISPR位点也没有在序列中注释。
要从序列中删除这些注释，请单击序列视图中条目名称左侧的箭头，然后选择删除条目。
未完，继续[5]
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